«СОВРЕМЕННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ
ДИАГНОСТИКИ ЧЕЛОВЕКА»
Из доклада д.б.н. Н. Рубцова.
За последнее десятилетие в исследовании хромосомных патологий
произошла откровенная революция. Ее сущность можно выразить
кратко: раньше рассматривали преимущественно морфологическое
строение хромосом, теперь научились выявлять в хромосомах
интересующие исследователя последовательности ДНК. Подход
оказался весьма продуктивным. К настоящему времени в практику
клинической диагностики уже внедрена большая серия новых методик.
Оказывается, возможна идентификация хромосомных районов и самих
хромосом с помощью цветного бар-кода, когда каждый район
специфическим образом окрашивается, и это можно наблюдать
визуально. Такой способ анализа называется многоцветным
бэндингом. Другой метод, достаточно давно разрабатываемый в
Институте цитологии и генетики СО РАН — микродиссекция
метафазных хромосом. Он заключается в микроманипуляционном
выделении аномальной хромосомы или ее района, выделении из нее
ДНК, последующем ее размножении и мечении. Гибридизация in situ
такого препарата ДНК с метафазными хромосомами пациента и
здорового донора позволяет определить происхождение и состав
аномальной хромосомы. Районы нормальных хромосом, соответствующие
районам аномальной хромосомы, при использовании такого метода
интенсивно окрашиваются.
Другим эффективным методом выявления нарушения баланса
хромосомных районов является сравнительная геномная гибридизация.
Одну ДНК-пробу получают из анализируемых тканей пациента,
другую — из ткани здорового донора. Их сравнение проводится
одновременной гибридизацией со стандартными хромосомами человека.
Различия в результатах гибридизации позволяют выявить увеличение
или уменьшение числа копий хромосомных районов в исследуемом
образце. В настоящее время этот метод широко используется при
хромосомном анализе клеток солидных опухолей.
С недавних пор в сравнительной геномной гибридизации метафазную
хромосому, используемую в качестве тестера, пытаются заменить
биологическими микрочипами. Для создания такого микрочипа на
специальную поверхность наносят клонированные последовательности
ДНК, характеризующие самые разные хромосомные районы. Проведение
конкурентной гибридизации нормальной и опухолевой ДНК и сравнение
интенсивностей их сигналов позволяет оценить количественные
соотношения последовательностей ДНК в клетке.
Перечисленные методы с успехом применяются как для решения
принципиальных научных проблем, так и для проведения клинической
диагностики. Однако, к сожалению, их чувствительности не всегда
хватает для решения некоторых проблем, связанных с врожденными
хромосомными патологиями. В реальной клинической диагностике
почти всегда приходится отрабатывать конкретный вариант
диагностического метода для решения конкретной задачи. Одной из
серьезных проблем, стоящих перед медицинской генетикой, является
оценка клинического значения малых сверхчисленных маркерных
хромосом.
 |
Метафазная пластинка с маркерной хромосомой. Интенсивно окрашена
маркерная хромосома и районы нормальных хромосом, содержащие ДНК,
гомологичную ДНК маркерной хромосомы. Стрелка указывает на
маркерную хромосому. Размерные стрелки указывают на районы
нормальных хромосом, содержащих ДНК, гомологичную ДНК маркерной
хромосомы.
|
Дополнительная 47-я хромосома, иногда очень маленькая по размеру,
встречается с частотой одна на тысячу человек. Определить ее
происхождение и состав достаточно сложно, а до появления методов
молекулярно-цитогенетической диагностики было просто невозможно.
Идентификация материала этих маркерных хромосом особенно важна
при проведении дородовой диагностики. В зависимости от состава
маркерной хромосомы, ее присутствие может либо никак не
отразиться на здоровье ребенка, либо привести к множественным
врожденным порокам развития.
Для анализа малых маркерных хромосом цитогенетики активно
используют различные технологии: анализ состава альфоидных ДНК в
центромерных районах маркерной хромосомы, флюоресцентную in situ
гибридизацию с ДНК-пробами, специфичными прицентромерным районам
индивидуальных хромосом. С их помощью возможно установить
происхождение лишней хромосомы. Первоначально это вызвало у
специалистов прилив энтузиазма. Но, к превеликому сожалению,
часто бывает, что информация, ценная для ученых, не имеет в
конкретном случае клинического значения. Так оказалось и на этот
раз. Почему? Все перечисленные методы позволяли определить
происхождение, но не состав маркерной хромосомы. Вопрос, какие
гены скрываются в маркерной хромосоме и какие последствия вызовет
ее присутствие в клетках человека, оставался открытым.
В попытках найти ответ на этот вызов была использована группа
новых методик: гибридизация ДНК-проб целых хромосом человека,
специфических ДНК-проб из соседствующих с центромерой
эухроматиновых районов, сравнительная геномная гибридизация.
Стало возможным выявлять в хромосомах эухромативные районы, т.е.
именно те, где находятся гены, нарушение числа копий которых
приводит к развитию патологий. Однако, общей проблемой данных
методов была их низкая чувствительность. Они давали надежные
результаты, если эухроматиновый район в маркерной хромосоме был
не менее 10 млн пар оснований. Частично проблему удалось решить
комбинированием используемых методов, но, несмотря на всю их
эффектность, точность описания аномальной хромосомы оставалась
недостаточной, чтобы охарактеризовать ее должным образом.
Стоимость же исследования и требования к используемому в
диагностике оборудованию непрерывно росли. В России проведение
таких исследований было возможно лишь в Институте цитологии и
генетики СО РАН и одном — двух федеральных Центрах по
медицинской генетике. Да и то такие исследования попадали скорее
в разряд научных экспериментов, нежели рутинной диагностики.
Разработка в ИЦиГ СО РАН метода микродиссекции хромосом и
получения ДНК-проб аномальных хромосом значительно расширила
возможности диагностики маркерных хромосом, а также позволила
снизить затраты на ее проведение. В три-четыре раза выросла
разрешающая способность диагностики. Использование этого подхода
позволяло установить и происхождение, и состав маркерной
хромосомы. Серьезным недостатком метода оставалась его
трудоемкость и необходимость привлечения специалистов высокой
квалификации. До сих пор, кроме ИЦиГ СО РАН, этим методом в мире
успешно пользуются еще 5-6 лабораторий. Обычно они берут на себя
роль центров, куда стекается материал для анализа. Но в России
такой подход оказался малоэффективным.
Сложилась ситуация, когда методы вроде бы есть, но применить их в
клинике достаточно сложно. Поэтому в Институте цитологии и
генетики постарались разработать упрощенный вариант диагностики
маркерных хромосом, который можно было бы использовать в обычных
диагностических центрах.
Идея предложенного подхода заключалась в следующем. В хромосоме
можно выделить две части: эухроматиновую, которая несет
гены — материал, существенный для развития любых признаков человека, и
гетерохроматиновую, содержащую в основном повторенные
последовательности и ничего особенно не кодирующую. Если
маркерная хромосома содержит только гетерохроматиновую
компоненту, то ее присутствие никак не отражается на здоровье ее
носителя, в то время как присутствие эухроматиновой компоненты
практически всегда ведет к формированию врожденных патологий
развития. К каким именно патологиям приведет присутствие такой
хромосомы зависит от того, какой эухроматиновый район входит в ее
состав. Но при дородовой диагностике информация о том, что
врожденные патологии будут иметь место, может оказаться
достаточной для принятия решения.
Задача была поставлена следующим образом: создать методику
выявления в маркерных хромосомах районов эухроматина. Как можно
простым способом разделить эу- и гетерохромативные районы?
Попытки подавить гибридизацию повторенных последовательностей ДНК
себя не оправдали. Сложная организация генома человека со
множеством кластеров повторенных и дуплицированных
последовательностей не позволила надежно дифференцировать эу- и
гетерохроматиновые районы с помощью такого подхода. Более
эффективным оказалось создание ДНК-пробы, базирующейся на
диспергированных повторенных последовательностях, характерных для
эухроматиновых районов и практически отсутствующих в районах
прицентромерного и теломерного гетерохроматина. Полученные таким
образом ДНК-пробы при проведении флуоресцентной in situ
гибридизации окрашивали только эуроматиновые районы, не
затрагивая районы гетерохроматина.
Данный метод был апробирован на 12-ти маркерных хромосомах,
которые предварительно были детально описаны с помощью метода
микродиссекции метафазных хромосом и флуоресцентной in situ
гибридизации с полученными ДНК-пробами маркерных хромосом и с
некоторыми ДНК-пробами клонированных последовательностей ДНК.
Полученные результаты полностью согласуются с описанием маркерных
хромосом, основанном на всем комплексе методов
молекулярно-цитогенетической диагностики. Предлагаемый простой и
доступный метод оценки клинического значения маркерных хромосом
дал адекватную оценку всем вовлеченным в исследование аномальным
хромосомам. Он позволил отличить маркерные хромосомы, в состав
которых входят районы, содержащие гены, от маркерных хромосом,
таких районов не содержащих. Результаты позволяют надеяться, что
метод найдет широкое применение в клинической диагностике.
Особенно полезным он может оказаться при проведении дородовой
диагностики, когда оценка маркерной хромосомы должна быть
проведена в предельно сжатые сроки.
Однако, окончательное заключение о возможностях использования
данного метода в клинической диагностике может быть дано только
после проведения испытаний на значительно более широкой выборке
маркерных хромосом.
стр. 4
|
