«Наука в Сибири» № 19 (2255) 12 мая 2000 г. КОНЕЧНАЯ ЗАДАЧА -- СОХРАНЕНИЕ ПРИРОДНЫХ АРЕАЛОВ Л. Попова, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Т. Лобова, стажер-исследователь, Институт биофизики СО РАН. Молекулярно-экологические исследования на озере Шира Сегодня в экологических исследованиях процессов, происходящих в природных системах, все больше используется возможность вести эти работы на молекулярном уровне. Но не только потому что "модно", а в силу необходимости получения более точно обоснованных оценок и прогнозов существования и развития природных объектов, важных по своей значимости для окружающей среды и для потребностей человека. Таким объектом, безусловно, считается являющееся популярным курортом оз.Шира в Красноярском крае. О результатах исследований бактериальной среды экосистемы этого озера рассказывают сотрудники публикуемой статьи. Постоянство функционирования любой экосистемы зависит от неизменности состава ее трофических звеньев и естественного биоразнообразия. В настоящее время наблюдается повсеместное давление факторов антропогенного происхождения на природные экосистемы, где микроорганизмы зачастую являются наиболее чувствительным звеном. Большую роль в выживаемости микробных популяций при давлении антропогенных факторов на экосистемы играют внехромосомные генетические элементы (плазмиды). Сейчас накоплено достаточно информации о широком распространении плазмид в природе. Кроме того, в последние годы с помощью методов генной инженерии, стало возможным создание рекомбинантных плазмид на основе природных. В их состав клонируются фрагменты гетерологичных геномов из ДНК различных организмов. Трансформированные рекомбинантными ДНК микроорганизмы получили название генетически модифицированные микроорганизмы (ГММО). Введение ГММО в окружающую среду может привести как к положительным, так и к отрицательным последствиям. Положительными результатами могут быть утилизация тех или иных соединений, придание защитных свойств растениям и животным; отрицательными -- появление в экосистемах новых внехромосомных генетических элементов, способных интегрироваться в клетках аборигенных микроорганизмов. Горизонтальное распределение плазмид в природных популяциях бактерий рассматривают как эволюционную функцию, связанную с адаптацией бактерий. В связи с возрастанием количества плазмид и их быстрой эволюцией, наблюдающейся в последние годы, встает вопрос о более детальном изучении природных популяций бактерий для выяснения молекулярных механизмов, связанных с горизонтальной передачей генов и функциональной значимостью природных плазмид. Очевидной также становится необходимость мониторинга природных и рекомбинантных плазмид, включающего оценку возможных путей их миграции между микроорганизмами различных экосистем, и оценку последствий такой миграции для окружающей среды в целом. Среди природных микроорганизмов в действительности происходит экологически значимый перенос генов. Трансформация в природе зависит от клеточных функций, обеспеченных генами, разбросанными по хромосоме. Из-за диффузного перемещения клеток в жидкой фазе, а также из-за тенденции как молекул ДНК, так и самих клеток адсорбироваться на твердых поверхностях, наиболее высокую вероятность трансформации можно ожидать в толще воды. Существование ДНК в природных условиях в виде кольцевой (свойство плазмид) двойной нити обеспечивает стабильное сохранение структуры при гибели клеток. Чтобы представить возможную картину распространения природных и рекомбинантных плазмид в природе, необходимо изучить естественный плазмидный профиль у микроорганизмов, обитающих в конкретных экосистемах с известной антропогенной нагрузкой. Одним из примеров природной водной экосистемы такого типа является оз.Шира. Постоянное использование органических и неорганических удобрений на пашнях и пастбищах приводит к тому, что вместе с дождями и ветрами происходит поступление в озеро пестицидов, фенолов, синтетически-поверхностных веществ, заносимой человеком и животными микрофлоры. Кроме того, попадающие в оз.Шира стоки из двух санаториев, использующих для лечения больных ряд антибиотических препаратов, приводят к отбору большого числа микроорганизмов, резистентных к антибиотикам, особенно в период "цветения" микроводорослей. Антибиотическая устойчивость аборигенной микрофлоры зачастую обуславливается наличием в бактериальных клетках плазмид. Распространение таких микроорганизмов в природной экосистеме, содержащих в векторной плазмиде гены резистентности к антибиотикам, будет интенсивнее, чем при хромосомном способе передаче признаков. Это, в свою очередь, представляет риск вытеснения аборигенной микрофлоры, неустойчивой к антибиотикам, или активной передачи ей этого признака. Большое экологическое значение для сохранения целостности микробного звена озера может иметь неспособность занесенной микрофлоры конкурировать с аборигенными микроорганизмами по ряду естественных экологических факторов. Однако наличие экологически значимых плазмид и их миграция к попадающей в озеро микрофлоре могут усилить адаптационные свойства последней, что позволит ей конкурировать за нишу обитания. С этим связана и проблема оценки механизмов самоочищения оз.Шира от занесенной микрофлоры, от чего зависит сохранение лечебных свойств воды и грязей курорта "Озеро Шира". Сравнение влияния минеральных солей, характерных для озерной воды, на выживаемость и метаболическую активность широко распространенных в естественных природных экосистемах представителей микрофлоры человека и животных, относящихся к семействам Enterobacteriacea и рода Bacillus, с их воздействием на занесенные микроорганизмы, может дать ключ к ответу на этот вопрос. На основании доминирующих групп микрофлоры, выделенных по отношению к осмотическому давлению в разных ареалах минерального озера Шира, было высказано предположение о неоднородности естественных экологических факторов акватории озера. Выделенный нами ранее класс природных плазмид у микроорганизмов, обитающих в оз.Шира, характеризующийся размерами менее 5 тыс. пар нуклеотидов, позволил начать исследования по определению функции этих плазмид и оценке возможной миграции определенных -- доминирующих -- плазмид в разных ареалах оз.Шира. Результатами такого мониторинга могут быть выявление путей миграции природных плазмид и выяснение механизмов (связанных с их функцией), определяющих их закрепление в микробном звене озера. Проблема распространения природных плазмид, особенно связанных с антибиотикорезистентностью и прогнозированием поведения генетически модифицированных микроорганизмов в природных экосистемах после их случайной или целенаправленной интродукции, выявляет три основных задачи. Прежде всего, это -- оценка способности интродуцированного микроорганизма к встраиванию в состав звена аборигенной микрофлоры вследствие адаптации в новых условиях окружающей среды и взаимодействия с конкурирующими за нишу обитания природными микроорганизмами. Вторая заключается в оценке вероятности миграции рекомбинантных плазмид внутри звена аборигенной микрофлоры и вероятности миграции природных плазмид, имеющих важное значение для выживания в условиях данной экосистемы, в клетки генетически модифицированных микроорганизмов. И третья -- это оценка вероятности сохранения рекомбинантной плазмиды и способности к экспрессии клонированных генов, как в исходно интродуцированном штамме, так и в возможных новых трансформантах, в истинных обитателях природных экосистем. Основная задача -- согласно программам, поддержанным грантами ФЦП "Интеграция", РФФИ, СО РАН, КФН (Красноярский фонд науки) -- состоит в разработке методологического подхода к изучению плазмидного профиля микрофлоры конкретных экологических ниш и оценке процессов миграции ГММО, а также рекомбинантных и природных плазмид в окружающей среде. Этот этап необходим, так как в природных экосистемах работает система "генетического котла", когда возможна миграция плазмид и других внехромосомных генетических элементов (как природных, так и рекомбинантных ДНК) между микроорганизмами, обитающими, например, в оз.Шира, а также в пограничных экологических нишах -- почвенной и пресноводной. Результатом такой миграции могут быть различные последствия для звена аборигенной микрофлоры и экосистемы в целом. Можно ограничиться двумя основными: занесенные плазмидосодержащие микроорганизмы (включая ГММО) либо выживают, либо гибнут. В дальнейшем могут наблюдаться следующие процессы: -- во всех исходах интродукции -- от полной гибели плазмидосодержащих микроорганизмов до их доминирования в звене занесенной микрофлоры, характерной для данного ареала -- всегда существует разной степени вероятность (причем, в случае интродуцентов она выше) освобождения рекомбинантной плазмиды; -- в многочисленных исследованиях показано: и в почве, и в воде плазмиды могут сохраняться длительное время -- до полугода, не теряя при этом способности к трансформации; -- чем выше вероятность миграции как рекомбинантных, так и природных плазмид, тем необратимее могут стать изменения в функционировании экосистемы в целом. Кроме миграции плазмид существует и процесс миграции микроорганизмов: как в разные ниши одной экосистемы, так и между экосистемами. При этом, если в данной экосистеме, в которой произошла случайная или целенаправленная интродукция генетически модифицированных микроорганизмов, вероятность миграции рекомбинантных плазмид низкая (вследствие отсутствия близкородственных микроорганизмов), то при переносе в отдаленные экосистемы по трофическим звеньям или с потоками воды риск миграции может повышаться. Наибольшую опасность в процессе широкого использования ГММО в различных областях человеческой деятельности представляет вероятность передачи им природных плазмид от аборигенных обитателей экосистем, имеющих существенное значение для выживания. Для оценки плазмидного профиля аборигенной микрофлоры из разных природных ареалов нами использовалась следующая методология: -- выделение доминирующих групп микроорганизмов; -- оценка функций по ряду селективных факторов: устойчивости к трем классам антибиотиков по типу действия и к осмотическому шоку; -- сравнение плазмидного профиля внутри каждой группы микроорганизмов для штаммов с различным отношением к селективным факторам. В результате анализа выборки из 300 штаммов микроорганизмов, выделенных из оз.Шира, отобрано 20, имеющих плазмиды размером менее 14 тыс. пар нуклеотидов. Плазмидонесущие штаммы составили 7%. Наиболее четко из всех исследованных нами природных плазмид прослеживается функция плазмиды размером 2,7 тыс. пар нуклеотидов (pSH1), которая присутствует в клетках практически всех умеренных и экстремальных штаммов. Предполагается связь ее функции с устойчивостью к осмотическому шоку. По устойчивости к антибиотикам анализ проводить сложнее, так как, например, векторные плазмиды, используемые для клонирования гетерологичного генома в бактериях и несущие устойчивость к ампициллину и канамицину, соответственно, имеют небольшие размеры. Очевидно, что проведение оценок влияния интродукции плазмидонесущих микроорганизмов и возможных новых трансформантов на целостность экосистем и естественное биоразнообразие необходимо осуществлять в лабораторных условиях. Такие оценки предполагают некоторое завышение степени риска миграции ГММО и рекомбинантных плазмид, но они оправданы конечной задачей сохранения природных ареалов. В природе, как правило, различные экосистемы не существуют изолировано друг от друга, а наоборот -- соприкасаются. В связи с этим микроорганизмы могут быть перенесены из одной системы в другую. При этом будет происходить перенос генетической информации и дальнейшее ее распространение. Наиболее наглядным примером распространения новых свойств среди аборигенной микрофлоры является постепенное распространение множественной антибиотикоустойчивости среди микрофлоры оз.Шира. В летний период особенно ярко проявляется антропогенное влияние на этот параметр экосистемы, так как с удалением от курортной зоны к центру озера наблюдается значительное уменьшение численности микрофлоры, проявляющей устойчивость к разным антибиотикам одновременно. Надо отметить, что среди аборигенной микрофлоры в зимний период процент устойчивых к ампициллину и канамицину микроорганизмов значительно снижается, а устойчивых к цифрану клеток пока не обнаружено (см. схему). Вертикальное (из поколения в поколение) сохранение плазмид в клетках микроорганизмов будет зависеть от активности селективного фактора среды. Горизонтальный способ распространения генов между различными микроорганизмами является более экологически значимым, чем вертикальный, и может оказывать определенное влияние на дальнейшую судьбу экосистемы. В связи с этим актуальность изучения зависимости между функциональной нагрузкой плазмид и факторами среды возрастает. Необходимо проведение многоплановых целенаправленных исследований, которые позволят оценить возможные пути миграции внехромосомных генетических элементов и их экологическую роль. г. Красноярск. На схеме: стрелка показывает снижение устойчивости микрофлоры к антибиотикам в акватории озера (по экспедициционным данным 1996--1998 гг.). стр.