«Наука в Сибири» № 3 (2389) 24 января 2003 г. САМЫЕ ГЛАВНЫЕ МОЛЕКУЛЫ На научной сессии Общего собрания СО РАН 15 декабря в ходе заседания, посвященного 50-летию открытия двойной спирали ДНК, академик В.Власов сделал доклад "Современные биотехнологии для медицинской диагностики и терапии". Предлагаем вниманию читателей статью, написанную по материалам доклада. Академик В.Власов Исследования в области химии и биохимии нуклеиновых кислот, проводившиеся в последние десятилетия, не только привели к революционным преобразованиям в биологии, но и оказали большое влияние на развитие других областей, таких, например, как супрамолекулярная химия. Уникальные свойства нуклеиновых кислот обусловлены особенностями их пространственного строения. Двойная спираль ДНК — это две ленты одноцепочечных ДНК, две полимерные цепочки, состоящие из мономеров-нуклеотидов. Цепочки удерживаются вместе за счет множества слабых взаимодействий между нуклеотидами, так называемых водородных связей. Водородные связи могут образовываться только между определенными парами нуклеотидов, находящихся друг напротив друга в цепочках: между G и C и между А и Т. Таким образом, двойную спираль могут образовать только те цепочки, в последовательности которых везде есть полное соответствие, т. е. везде в противоположных цепях расположены упомянутые пары нуклеотидов. Цепочки, которые полностью соответствуют друг другу и образуют спираль, называются комплементарными. Двойные спирали ДНК могут образовываться как длинными цепочками, состоящими из тысяч нуклеотидов (это размеры генов), так и относительно короткими, состоящими из нескольких десятков нуклеотидов (их называют олигонуклеотидами). Из особенностей структуры ДНК вытекают важные следствия. Во-первых, ДНК — это информационный биополимер. В ее последовательности чередованием четырех упомянутых букв-нуклеотидов можно записывать информацию. На таком языке можно писать просто текст, и была даже опробована возможность использования ДНК-записей в криптографии. Так как речь идет о записи на молекулярном уровне, плотность записи информации в ДНК очень высока. Наверное, всю информацию, накопленную человечеством, можно записать на ДНК, которая может быть упакована в один кубический миллиметр. Вторая важная особенность — взаимодействие двух цепочек в структуре ДНК. Образовать спираль могут только цепочки с определенными последовательностями нуклеотидов, такие, где есть соответствие последовательности нуклеотидов, нужное для образования водородных связей (Т напротив А и G напротив C). Поэтому цепочка ДНК найдет себе в растворе подходящую пару из множества возможных других вариантов и образует спираль только с ней. Это явление, называемое молекулярным узнаванием, широко используется в различных практически важных системах. Например, фрагменты цепочек ДНК, олигонуклеотиды, используются в качестве узнающих структур, находящих определенные цепочки ДНК с целью их идентификации (например, характерных вирусных генов), или для присоединения к нуклеиновым кислотам различных веществ. Если в какой-то системе имеется множество (обычно миллионы) молекул разных нуклеиновых кислот, и в нее добавить определенный олигонуклеотид, то он найдет в присутствующих нуклеиновых кислотах подходящую себе комплементарную последовательность и образует с ней комплекс. Именно так обнаруживают мутантные гены с необычными последовательностями. Свойство избирательного комплексообразования открывает широчайшие возможности в супрамолекулярной химии, поскольку позволяет избирательным образом создавать в пространстве сложнейшие структуры, которые собираются сами по себе. В природе широко распространены два типа нуклеиновых кислот — ДНК и РНК. Они очень похожи. Но есть небольшая разница, которая приводит к существенным химическим отличиям. Исторически первой была открыта ДНК, ее структура изучена первой и установлена ее ключевая роль в хранении генетической информации клеток. Поэтому профессор М. Франк-Каменецкий назвал свою книгу о ДНК "Самая важная молекула". На сегодняшний день установлено, что наиболее древняя молекула — РНК, и она не менее важна, чем ее родственница — ДНК. За исследования нуклеиновых кислот присужден ряд Нобелевских премий: тем, кто открыл их структуру, кто научился синтезировать нуклеиновые кислоты и расшифровал генетический код, кто открыл ферменты, позволившие манипулировать с ДНК, создал генную инженерию, кто научился определять последовательность нуклеиновых кислот (секвенировать нуклеиновые кислоты). Кстати, справедливости ради следует отметить, что в действительности первым предложил современные принципы секвенирования нуклеиновых кислот академик Е.Свердлов. Свое исследование в этой области он выполнил, находясь в командировке в Академгородке. Нобелевскими премиями отмечены открытия каталитических нуклеиновых кислот. Оказалось, что РНК и ДНК — это не просто носители генетической информации, они обладают гораздо более широким спектром возможностей, могут катализировать различные реакции, образовывать комплексы практически с любыми молекулами. Последнее в серии значительных событий в области изучения нуклеиновых кислот на сегодняшний день — открытие так называемой полимеразной цепной реакции. Думаю, уже в ближайшее время будут еще Нобелевские премии за работы с нуклеиновыми кислотами, и среди лауреатов должны быть российские ученые. В настоящее время секвенирование нуклеиновых кислот стало рутинной работой. Любая современная западная лаборатория имеет автоматические секвенаторы. И у нас несколько лет назад, благодаря поддержке руководства Сибирского отделения, появился, наконец, такой прибор. Он установлен в Центре коллективного пользования, и на нем ведутся разнообразные биологические и медико-генетические исследования. Естественно, что при изучении последовательностей нуклеиновых кислот внимание в первую очередь обращалось на вирусные РНК и ДНК. Кстати, геном вируса клещевого энцефалита был расшифрован в Новосибирске, в нашем Институте биоорганической химии Александром Георгиевичем Плетневым с сотрудниками. Замечу, что одним из первых в стране технику секвенирования нуклеиновых кислот стал развивать чл.-к. РАН Михаил Александрович Грачев. Под его руководством были начаты исследования в этой области в лаборатории А.Плетнева. Основная работа по секвенированию генома человека была выполнена за последние 20 лет в основном без участия России (по причинам, вполне понятным). Огромные успехи достигнуты в химическом синтезе нуклеиновых кислот. Сегодня можно химико-ферментативными методами синтезировать любую нуклеиновую кислоту. Расположенная в Академгородке фирма "Биоссет" — единственная в России, производящая приборы для автоматического синтеза нуклеиновых кислот, полностью обеспечивает потребности страны. Способность нуклеиновых кислот к молекулярному узнаванию открывает возможность создания комплексов любой конфигурации. Олигонуклеотиды, содержащие определенные последовательности, сами способны в пространстве собираться в самые разные конструкции. В них заложены возможности присоединения различных молекул. Такие комплексы могут быть самой разной конфигурации и использоваться для образования разных структур, например, для микроэлектроники. То есть, это способные к самосборке микрообъекты. За счет взаимодействия олигонуклеотидов можно, например, протянуть провода между определенными точками микрообъектов. Два олигонуклеотида из этих точек находят друг друга и образуют спираль. На нее осаждают ионы серебра, и получается проводник. На основе ДНК можно изготовить материалы, которые другими методами не сделать, например, сэндвичи из золота и серебра для целей микроэлектроники. Из молекул ДНК (отдельных молекул!) можно сделать молекулярные машины, которые способны осуществлять и вращательное, и поступательное движения за счет химических сигналов. Можно сделать элементы для записи информации. Для этого на поверхности следует присоединить олигонуклеотиды. Запись информации может производится за счет образования комплексов с комплементарными олигонуклеотидами. Информацию можно считывать, снимая олигонуклеотид и идентифицируя его. С такими элементами можно осуществлять основные операции, которые делаются на современном компьютере. Фрагменты ДНК можно использовать как молекулярные штрих-коды. Такие ДНКовые метки применимы для самых разных объектов — отдельных органических молекул, нанообъектов, генетических объектов, растений и животных. Как в супермаркете считывают по штрих-коду название продукта, срок годности и изготовителя, точно также любую информацию можно записать с помощью ДНК про любой объект. Упоминавшийся отмеченный Нобелевской премией принцип полимеразной цепной реакции (ПЦР) открыл огромные возможности в самых разных областях науки и техники, создал совершенно новые возможности в биотехнологии, медицине, криминалистике. Принцип чрезвычайно прост. Цепочки спирали ДНК можно разделить, и с помощью ферментов синтезировать на них комплементарные им цепочки (именно так копируется и размножается в клетке генетический материал). В результате будут получены две идентичные копии исходной двойной спирали. Повторив эту операцию еще раз, можно получить 4 копии. Операцию можно повторять многократно и получить, в соответствии с геометрической прогрессией, практически неограниченное количество копий генетического материала. Процесс этот легко осуществим с помощью простых автоматических приборов, и действительно, из одной молекулы ДНК можно наработать, если нужно, хоть тонну идентичных молекул. Открытие полимеразной цепной реакции позволило создать новое направление, которое сейчас стало развиваться и биологами, и химиками (комбинаторная химия). Если химический синтез ДНК проводить не путем последовательного присоединения определенных нуклеотидов, а из смеси всех четырех мономеров, то получится не ДНК с определенной последовательностью, а смесь разных молекул с разными последовательностями (миллионы вариантов). Если с помощью ферментов синтезировать их РНК-копии, то получится много миллионов РНК разной последовательности. Все они свернутся в свои пространственные структуры, которые будут совершенно различны. Пространственная организация определяет свойства, поэтому среди миллионов молекул будут присутствовать самые разные, к примеру, молекулы, связывающие аспирин. Если добавить аспирин в раствор с такой смесью РНК, то найдутся молекулы, которые образуют с ним комплекс. Можно выделить этот комплекс, размножить содержащуюся в нем РНК с помощью ПЦР, и прочитать ее последовательность. Таким образом будет получено вещество, которое связывает аспирин, будет установлена его структура и будет очевиден способ его синтеза. Точно также можно получить молекулы, которые будут связываться с любыми другими заданными молекулами. Такие РНК, способные связывать определенные вещества, называют аптамерами, от латинского слова "аптус", связывание. В настоящее время получено много тысяч аптамеров, которые находят все более широкое применение в медицине и в технике. Если вести отбор молекул РНК из смеси не по принципу образования комплексов, а по способности катализировать определенные реакции, то можно получить построенные из РНК катализаторы, работающие в водной среде. Аналогичный подход позволяет осуществлять молекулярную эволюцию. Можно сделать систему смеси РНК саморазвивающейся, если ввести мутагенез на стадии размножения последовательностей отобранных РНК, и многократно повторять отбор с мутантными РНК. При этом получится дарвиновская система, поскольку смесь РНК будет эволюционировать — в ней будут появляться и ускоренно размножаться молекулы с заданным свойством. Понятно, что все результаты, полученные при изучении нуклеиновых кислот, имеют, в первую очередь, приложения в области медицины. В медицине имеется множество задач, которые на сегодняшний день не решаются. Мы не умеем уничтожать инфекционные агенты в пораженном организме. Остро стоят проблемы СПИДа, гепатита и туберкулеза. Нельзя забывать о проблемах, связанных с биотерроризмом и вновь возникающими инфекциями. Для выявления инфекционных агентов огромное значение имеет ПЦР, позволяющая размножить следовые количества материала и олигонуклеотидные узнающие системы, ДНК-чипы. ДНК-чипы — это устройства, на поверхности которых в шахматном порядке располагаются олигонуклеотиды с различными последовательностями. Их может быть несколько десятков тысяч на одном квадратном сантиметре. На поверхности чипа анализируемая нуклеиновая кислота свяжется в точках, где расположены комплементарные ей олигонуклеотиды. Считывание сигналов из точек связывания дает информацию о наличии в анализируемой нуклеиновой кислоте определенных последовательностей. Такие системы широко используются во всем мире для целей диагностики — для обнаружения генов инфекционных агентов и мутантных генов человека. Развитие этой техники позволит создать простые экспресс-методы тонкого анализа генома человека для определения всего спектра характерных последовательностей в структуре генома индивидуума. Фактически это приведет к тому, что у каждого человека появится свой генетический паспорт. Каждый будет знать, какие у него есть мутации, какими болезнями он может заболеть, какими профессиями овладеть, а какие ему противопоказаны. Следует отметить, что ДНК-чипы были изобретены у нас в стране в Институте молекулярной биологии РАН, в лаборатории академика А.Мирзабекова. Эти разработки несомненно будут оценены Нобелевской премией. Очевидно, что научившись воздействовать на определенные нуклеиновые кислоты, можно лечить любые болезни. Разрабатываются разные варианты генной терапии, причем некоторые из них уже используются — методы так называемой заместительной терапии. Практически используется экс виво генотерапия, когда клетки костного мозга извлекаются из организма, в них вводят генетическую конструкцию, и затем имплантируют вновь в организм. Делается это в том случае, если у человека какой-то собственный ген не работает. А клетка с геном, введенным извне, действует в организме и помогает ему. Более сложный вариант — когда ген вводят непосредственно в клетки организма, в органы. Такие операции выполняются с помощью вирусных или химических векторов. Но здесь существует проблема биобезопасности. Дело в том, что вирусные векторы небезобидны, а введенная ДНК может вызывать мутации. Поскольку эти варианты генотерапии не изучены в полной мере, их пока применяют в исключительных случаях. Другой вариант генотерапии реализуется для инактивации генов, например, когда нужно "выключить" вредный ген, внесенный инфекционным агентом, или ген, который вызывает опухолевое перерождение клеток. Такие технологии (их назвали антисмысловыми) сейчас уже широко применяют в биологических исследованиях, начаты работы по созданию терапевтических препаратов. Идея синтезировать олигонуклеотид, взаимодействующий с вирусной нуклеиновой кислотой или какой-либо другой нуклеиновой кислотой, которую нужно инактивировать. Олигонуклеотид сам найдет свою жертву, комплементарную последовательность в целевой нуклеиновой кислоте и свяжется с ней. Задача химиков — присоединить к олигонуклеотиду такие группы, чтобы РНК-мишень оказалась уничтоженной. Замечу, что эта технология изобретена здесь, в Новосибирске, под руководством академика Д.Кнорре, за 10 лет до того, как аналогичные предложения были сделаны на Западе. Факт признан международным научным сообществом. Эта работа — также кандидат на Нобелевскую премию. Хотя исследования нуклеиновых кислот уже вышли на стадию создания технологий, исследования их биологических функций приносят все новые сюрпризы. Совсем недавно выяснилось, что основа основ жизни — РНК. Она является праматерью всего, с нее начиналась жизнь. Когда-то был "Мир РНК", существовали только молекулы РНК, не было ни белков, ни ДНК. РНК — единственная молекула, которая сама умеет все: содержит в себе генетическую информацию, катализирует реакции, образует комплексы с любыми классами соединений. Как выясняется, РНК играет важнейшую роль в работе генов высших организмов. Одно из главных научных достижений 2002 года — открытие роли малых РНК в функционировании генов. Открыты новые, основанные на РНК, механизмы, которые позволяют клетке бороться с вирусными инфекциями, механизмы выключения определенных генов. Уже сейчас ясно, что эти механизмы могут быть использованы и в медицине, и в растениеводстве, и в фундаментальных исследованиях. Горячей точкой исследований в биологии в ближайшие годы будет химия и биохимия нуклеиновых кислот. стр. 5