математическое моделирование
ВВЕДЕНИЕ.
Молекулы бикарбоната (CO32- и HCO3-) играют важную роль в функционировании биосистем. Это не удивительно, если вспомнить, что жизнь зародилась в условиях высоких концентраций CO2 в атмосфере, а следовательно, HCO3- и CO32- в Мировом Океане.
Функциональная активность фотосистемы 2 (ФС2) также подвержена влиянию ионов бикарбоната. Биологическая роль ФС2 заключается в передаче электронов от воды на пластохинон, далее - на фотосистему 1 через цепь переносчиков, окисляя при этом две молекулы воды до молекулярного кислорода. Впервые необходимость бикарбоната (БК) для максимальной активности ФС2 была показана еще в 1958 году Варбургом и Криппалом (1). Обнаруженный эффект на донорной и акцепторной сторонах ФС2 был назван "бикарбонатным".
Ряд экспериментальных данных, полученных в нашей лаборатории, показывает необходимость бикарбоната (БК) для поддержания стабильности и наиболее эффективного функционирования фотосистемы 2 высших растений. Недавние данные свидетельствуют о том, что БК может участвовать в сборке активного водоокисляющего комплекса (ВОК) (2). На основании этих данных было высказано предположение, что БК может связываться в ВОК ФС2 (2,3,4), который включает 4 Mn, ряд близлежащих а.о., ионы Cl- и Ca2+. Неясным остается вопрос, в какой форме бикарбонат лигандируется в ВОК.
Далее в нашей лаборатории было показано, что наряду с бикарбонатом несколько органических кислот (лактат, гликолат, малат, салициловая кислота) усиливают донирование электронов от марганца на P680 в исходно "разобраном" ВОК также, возможно, за счет облегчения его сборки. Наиболее сильный эффект наблюдался при добавлении к системе ВОК лактата. Сукцинат затруднял донирование электронов в данных экспериментах (5).
При проведении компьютерного эксперимента стояли две задачи:
1) определить, в какой форме БК связывается в ВОК;
2) может ли обнаруженный стимулирующий электрон-транспортный эффект являться следствием стабилизирующего действия бикарбоната и кислот.
Для решения поставленных задач была проведена молекулярно-механическая оптимизация водоокисляющего комплекса фотосистемы 2 цианобактерий в присутствии ионов бикарбоната (СО32- и HCO3-), лактата и сукцината.
МЕТОДЫ.
Для моделирования взаимодействия лигандов с компонентами водоокисляющего комплекса была использована трехмерная структура ФС2 [1w5c] из открытой базы данных 3-D структур [http://www.rcsb.org/pdb]. Данная структура фотосистемы 2 была расшифрована с разрешением 3.2A (6).
Предположительные сайты связывания лигандов внутри ВОК были определены из молекулярно-механических расчетов в программе HyperChem7.0 по следующей схеме:
1) Создание 2D-структуры лиганда
2) Преобразование 2D- в 3D-структуру молекулярным моделированием
3) Геометрическая оптимизация лиганда методом молекулярной механики ММ+ (алгоритм Polak-Ribiere, градиент 0.001 ккал/моль)
4) Локализация лиганда в различные области ВОК
5) Геометрическая оптимизация "вырезанной" сферы ВОК радиусом 11.5A с ионами бикарбоната, 15A с ионами лактата и 17A - сукцината с центром Mn1 [подход - гибкий лиганд/фиксированный сайт связывания (7). Используемый метод - молекулярная механика ММ+, алгоритм Polak-Ribiere, градиент 0.001 ккал/моль]. Сферы "вырезались" для облегчения манипулирования "тяжелой" трехмерной структурой [31578 атомов]. Именно данный "околомарганцевый" сайт является предположительным местом связывания БК.
6) Определение локальных минимумов по формуле Есвязывания=Екомплекс-(ЕВОК + Елиганд), т.е. определение сайтов связывания лигандов с наибольшей Е связывания
РЕЗУЛЬТАТЫ.
При таковых исходных параметрах для молекулы CO32- было найдено 5 локальных минимумов в серии опытов из 12 повторностей с максимальным выигрышем энергии 6.694 ккал/моль. В то время как для молекулы HCO3- было обнаружено 13 возможных мест связывания (видимо, их намного больше) из 15 повторностей. Максимальное значение минимумов потенциальной энергии составило -9.184 ккал/моль.
Для молекулы лактата (C3H5O3-) было обнаружено 13 локальных минимумов потенциальной энергии (видимо, их больше) из 14 повторностей с максимальной Есвязывания = -19.167 ккал/моль.
Сукцинат (C4H4O42-) также стабилизировал ВОК с максимальным выигрышем энергии при лигандировании 19.529 ккал/моль. Обнаружено 12 энергетических минимумов при 13-ти повторностях.
В связывание молекул бикарбоната и кислот в области Mn-кластера преимущественный вклад давали силы Ван-дер-Ваальса, а так же электростатические взаимодействия. При этом геометрия лигандов и их потенциальные энергии менялись незначительно в сравнении с условиями вакуума. Для молекулы сукцината в ВОК наибольший прирост собственной энергии составил +6.691, для лактата +4.960, HCO3- - +0.045, CO32- - +0.010 ккал/моль.
ВЫВОДЫ.
Из проведенных экспериментов следует, что 1) все исследованные лиганды стабилизируют водоокисляющий комплекс фотосистемы 2, следовательно, могут участвовать в его сборке; 2) из наличия нескольких локальных минимумов следует, что одновременно в ВОК могут связываться несколько молекул CO32-, HCO3- или других лигандов (лактат, сукцинат); 3) связывание сукцината в ВОК наиболее энергитически выгодно; 4) бикарбонат предпочтительнее связывается в ВОК в форме HCO3-.
Хотя экспериментальные данные свидетельствуют о снижении донирования электронов от марганца на P680 сукцинатом, молекулярно-механические расчеты показывают, что данный ион имеет несколько мест лигандирования со снижением общей потенциальной энергии системы. Видимо, стимулирующий передачу электрона эффект бикарбоната и исследованных кислот обусловлен не стабилизирующим влиянием на ВОК, а каким-то другим.
ЛИТЕРАТУРА
1. Warburg O., Krippahl G. Hill-Reaktionen // Z Naturforsch 13b: 509-514
2. Baranov S.V., Tyryshkin A.M., Katz D. Et al. Bicarbonate Is a Native Cofactor of the Manganese Cluster of the Photosynthetic Water Oxidizing Complex. Kinetics of Reconstitution of O2 Evolution by Photoactivation // Biochemistry 2004
3. Klimov V.V., Hulsebosch R.J., Allakhverdiev S.I. et al. Bicarbonate May Be Required for Ligation of Manganese in the Oxigen-Evolving Complex of Photosystem II // Biochemistry, 1997, 36, pp. 16277-16281
4. Klimov V.V., Allakhverdiev S.I., Baranov S.V. et al. Effect of bicarbonate and formate on the donor side of Photosystem 2 // Photosynthesis Research, 1995, 46, pp. 219-225
5. Unpublished Report
6. Biesiadka J., Loll. B., Kern J. Et al. Crystal Structure of Cyanabacterial Photosystem II at 3.2 A Resolution: A Closer Look at the Mn-Cluster // Phys. Chem. Chem. Phys. 2004. №6. p.4733
7. Lorber and Shoichet D.M., Shoichet B.K. Flexible Ligand Docking Using Conformational Ensembles // Protein Science. 1998. №7. Pp. 938-950