О ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И ЗАДАЧАХ БИОТЕХНОЛОГИИ
Л.Попова, кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник
Института биофизики СО РАН;
Е.Максимова, аспирант ИБФ СО РАН.
Роль ключевых факторов окружающей среды
в сохранении
рекомбинантных плазмид
и экспрессии клонированных генов
Ведущиеся в последние годы работы по целенаправленному созданию
микроорганизмов с новыми свойствами современными методами генной
инженерии содержат многообещающие перспективы решения задач
биотехнологии и охраны окружающей среды. Но это же ставит и
серьезные проблемы экологического характера, связанные с
опасностью их распространения в природе.
Наибольшее опасение вызывают генетически модифицированные
(измененные) микроорганизмы (ГММО), которые предполагается в
перспективе широко использовать в различных областях человеческой
деятельности. Как правило, такие организмы несвойственны
природным экосистемам и при большом количестве интродуцируемых
клеток вполне могут изменить процессы, происходящие в
естественных природных сообществах микроорганизмов.
Причем, в принципе возможно изменение свойств самих
интродуцентов. Это связано не только с нормальным
функционированием экосистем, при этом существует и
непосредственная опасность для человека, поскольку возможно
распространение рекомбинантной ДНК среди природных штаммов
микроорганизмов, в том числе, и патогенных. Так, например, в свое
время была обнаружена возможность быстрого распространения
множественной антибиотикоустойчивости среди природных
микроорганизмов при бесконтрольном применении антибиотиков в
клинике.
Эксперименты в лабораторных микроэкосистемах, проводящиеся в
институте, являются промежуточным этапом между лабораторным
культивированием генноинженерных микроорганизмов и полевыми
испытаниями. Это позволяет получить необходимые данные для оценки
вероятности распространения рекомбинантных штаммов в природных
экосистемах и, в том числе, оценить последствия их применения на
практике.
Для экспериментов такого типа разработана специальная модельная
система, включающая в себя модельный организм -- штамм бактерий
ГММО, содержащий рекомбинантные плазмиды с клонированными в них
генами -- и набор лабораторных микроэкосистем (МЭС) различного
состава. Такая система -- при наличии контроля параметров МЭС и при
детальном изучении свойств клонов, доминирующих в популяции
интродуцированного штамма -- позволяет выделить ключевые факторы,
оказывающие наиболее существенное влияние на выживаемость
генетически измененных микроорганизмов,
стабильность сохранения рекомбинантной плазмиды и экспрессии
клонированных генов.
В наших исследованиях в качестве модельного объекта использовался
штамм бактерии Escherichia coli Z905, содержащий рекомбинантную
плазмиду, в составе которой находятся клонированные гены
люминесцентной системы морских светящихся бактерий Photobacterium
leiognathi.
Известно, что уровень биолюминесценции суспензии светящихся
бактерий, как морских свободноживущих и симбиотических, так и
рекомбинантных, определяется концентрацией фермента люциферазы в
клетках, а также внутриклеточной концентрацией субстратов
реакции. В связи с этим возможность использования клонированных
генов люминесцентной системы фотобактерий в качестве маркера
представляет большие удобства при скрининге бактерий, содержащих
рекомбинантные ДНК. В принципе, это позволяет следить за
миграцией клонированных генов, изучать механизмы и эффективность
их экспрессии как в исходном, так и в природных штаммах
микроорганизмов, захвативших рекомбинантные плазмиды.
Как известно, лабораторные изолированные микроэкосистемы можно
сконструировать двумя принципиально отличающимися способами. В
первом случае микроэкосистема представляет собой небольшую часть
типичной природной экосистемы, взятую из заранее выбранного
участка и помещенную в лабораторные условия. Микрокосмы этого
типа в процессе своего развития имитируют процессы, происходящие
в реальных природных экосистемах, из которых они были взяты, --
вопрос только в представительности видов и подобии физико- и
гидрохимических условий их существования. Другой способ создания
микроэкосистем заключается в подборе, до некоторой степени
произвольном, организмов, находящихся в определенных пищевых
отношениях друг с другом и способных нормально развиваться в
лабораторных условиях.
Отметим, что в таких экспериментах не столь обязательно
максимально полное подобие этих микрокосмов реально существующим
природным экосистемам, здесь преследуется другая цель. С их
помощью можно смоделировать биотический круговорот целиком в
небольшом лабораторном сосуде, или, например, изучить влияние
более высоких звеньев трофических цепей на низшие и исследовать
круговорот в целом, что трудно осуществить в микроэкосистемах
первого типа. В целом же эти два способа конструирования
микроэкосистем не исключают, а взаимно дополняют друг друга и
являются необходимыми этапами в прогнозных исследованиях.
Выделение ведущих факторов различных экосистем позволяет, кроме
того, проводить исследование влияния этих факторов на генетически
модифицированные микроорганизмы в различных сочетаниях с
использованием стандартных микробиологических методов: на чашках
Петри, в пробирках, в колбах. Это позволяет значительно ускорить
исследование процессов адаптации таких микроорганизмов в тех или
иных условиях.
В частности, проведена оценка влияния таких ключевых факторов как
концентрация питательных веществ и селективного для плазмидных
генов фактора (в нашем случае -- ампициллина) на изменение
экспрессии клонированных в плазмиде lux-генов.
Установлено, что состав среды -- например, с низкой или высокой
концентрацией питательных веществ -- оказывает существенное
влияние на стабильность сохранения плазмиды и экспрессию
клонированных генов. Речь идет, в частности, о механизме
адаптации генома рекомбинантной плазмиды.
Присутствие селективного фактора в среде существенного влияния на
механизм изменения регуляции плазмидных lux-генов не оказывало.
В первые месяцы опытов после интродукции рекомбинантного штамма
E. coli Z905 в модельные водные микроэкосистемы наблюдаемое
снижение уровня свечения клеток в большинстве случаев было
вызвано как уменьшением числа плазмидных копий, так и нарушением
синтеза альдегидного фактора люциферазы. При дальнейшей адаптации
клеток E. coli Z905 к условиям микроэкосистемы наблюдалось
ослабление контроля экспрессии lux-генов с последующим усилением
их регуляции.
В результате трансформации в неспецифических условиях показана
принципиальная возможность передачи рекомбинантной плазмиды pPHL7
в клетки микроорганизмов, выделенных из модельных микрокосмов.
Установлено, что в клетках Flavobacterium spp. возможна активная
экспрессия lux-генов, что обусловлено наличием необходимых
регуляторных компонентов, а также субстратов люциферазной
реакции. Показано, что даже в условиях среды с высоким
содержанием питательных веществ длительное поддержание высокого
уровня люминесценции маловероятно и наблюдается более сильная
гетерогенность популяции с преобладанием слабосветящихся клеток
по сравнению со штаммом E. coli Z905.
Таким образом, на примере модельного микроорганизма с
клонированными в рекомбинантной плазмиде маркерными lux-генами,
удалось отработать методический подход, который позволил оценить
возможные механизмы адаптации плазмидного генома при влиянии двух
ключевых факторов окружающей среды. Изменяя в экспериментальной
модели факторы, характерные для различных природных экосистем,
можно проследить за динамикой и механизмами изменения экспрессии
клонированных lux-генов. Предварительный прогноз будущего
поведения как самих генетически модифицированных микроорганизмов,
так и рекомбинантных ДНК после случайной или целенаправленной
интродукции в окружающую среду должен обеспечить безопасное
использование современных биотехнологий.
Работа выполнена при грантовой
поддержке Сибирского отделения РАН для молодых ученых.
г. Красноярск.
стр.
| 
